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核酸分子杂交仪,核酸的鉴定、保存与应用

(一)核酸的鉴定1.浓度鉴定核酸分子杂交仪 核酸浓度的定量鉴定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。(1)紫外分光光度法:紫外分光光度法是基于核酸分子成分中的碱基均具有一定的紫外线吸收特性,最大吸收波长在250nm~270nm之间。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后,其最大吸收波长不变。由核苷酸组成核酸后,其最大吸收波长为260nm,该物理特性为测定溶液中核酸的浓度奠定了基础。在波长260nm的紫外线下,1个OD值的光密度大约相当于50μg/ml的双链DNA,38μg/ml的单链DNA或单链RNA,33μg/ml的单链寡聚核苷酸。如果要精确定量已知序列的单链寡核苷酸分子的浓度,就必须结合其实际分子量与摩尔吸光系数,根据朗伯-比尔定律进行计算。若DNA样品中含有盐,则会使A260的读数偏高,尚需测定A310以扣除背景,并以A260与A310的差值作为定量计算的依据。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液,价格300元2.纯度鉴定 紫外分光光度法还是荧光光度法,均可用于核酸的纯度鉴定。 (1)紫外分光光度法:紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中,纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯RNA的A260/A280比值为2.0。比值升高与降低均表示不纯。其中蛋白质与在核酸提取中加入的酚均使比值下降。蛋白质的紫外吸收峰在280nm与酚在270nm的高吸收峰可以鉴别主要是蛋白质的污染还是酚的污染。RNA的污染可致DNA制品的比值高于1.8,故比值为1.8的DNA溶液不一定为纯的DNA溶液,可能兼有蛋白质、酚与RNA的污染,需结合其它方法加以鉴定。A260/A280的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标,2.0是高质量RNA的标志。但要注意,由于受RNA二级结构不同的影响,其读数可能会有一些波动,一般在1.8~2.1之间都是可以接受的。另外,鉴定RNA纯度所用溶液的pH值会影响A260/A280的读数。如RNA在水溶液中的A260/A280比值就比其在Tris缓冲液(pH 7.5)中的读数低0.2~0.3。(2)荧光光度法:用溴化乙锭等荧光染料示踪的核酸电泳结果可用于判定核酸的纯度。由于DNA分子较RNA大许多,电泳迁移率低;而RNA中以rRNA最多,占到80%~85%,tRNA及核内小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故总RNA电泳后可呈现特征性的三条带。在原核生物为明显可见的23S、16S的rRNA条带及由5S的rRNA与tRNA组成的相对有些扩散的快迁移条带。在真核生物为28S、18S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA构成的条带(图6-1)。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不见的。通过分析以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果,我们可以鉴定DNA制品中有无RNA的干扰,亦可鉴定在RNA制品中有无DNA的污染。3.完整性鉴定 常规使用凝胶电泳法。(1)凝胶电泳法:以溴化乙锭为示踪染料的核酸凝胶电泳结果可用于判定核酸的完整性。基因组DNA的分子量很大,在电场中泳动很慢,如果有降解的小分子DNA片段,在电泳图上可以显著地表现出来。而完整的无降解或降解很少的总RNA电泳图,除具特征性的三条带外,核酸分子杂交仪三条带的荧光强度积分应为一特定的比值。沉降系数大的核酸条带,分子量大,电泳迁移率低,荧光强度积分高;反之,分子量小,电泳迁移率高,荧光强度积分低。一般28S(或23S)RNA的荧光强度约为18S(或16S)RNA的2倍,否则提示有RNA的降解。如果在加样槽附近有着色条带,则说明有DNA的污染(2)其它方法:必要时,还可以通过一些特殊的试验来分析RNA的完整性,如小规模的第一链cDNA合成反应、以放射性标记的寡脱氧胸苷酸oligo(dT)为探针的Northern杂交以及对已知大小的mRNA的Northern杂交。另外,随着毛细管电泳与生物芯片技术的飞速发展,有关核酸的分离、纯化、鉴定与回收的手段日益丰富。(二)核酸的保存核酸的结构与性质相对稳定,无需每次制备新鲜的核酸样品,且一次性制备的核酸样品往往可以满足多次实验研究的需要,因此有必要探讨核酸的贮存环境与条件。与分离纯化一样,DNA与RNA的保存条件也因性质不同而相异。

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